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蛋白纯化常见问题总结
点击次数:6339 发布日期:2014-9-12  来源:本站 仅供参考,谢绝转载,否则责任自负

蛋白纯化过程中常遇见一些问题,这里整理了以下几个蛋白纯化实验中遇见的问题及其解决方案。

1)我现在手头有个融合蛋白,纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析,之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。

请问有哪些可能会出现这种原因?怎么解决?测过基因序列,没有问题。细胞破碎后,融合蛋白在沉淀里,我用助溶剂提取后,可以用GST做亲和层析,但效率只有50%~60%左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂,但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀,我用0.5%CHAPS助溶可勉强溶解部分,目的蛋白疏水性比较强。

既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性,这样溶解就会好得多,此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性,同时保护你的蛋白,你再做纯化就可以了,我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG-5000,这样的情况下蛋白还是活性回收率很高,我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好,你失去活性你可以监测一下提取,纯化,酶切到底哪里失去了活性,这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液PH值,看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点,这也是个办法。

2)请问有没有合成过配体为FMN的亲和胶?

亲和的填料合成过20来种,你是希望用它来纯化某种脱氢酶吗,我看FMN可偶联的有限,倒是FAD有活泼的氨基好偶联,何况它们几乎是同一个辅酶,你是不是考虑把FAD连上去。当然FMN的结构上也有个仲胺,可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上,而溴化氰活化或别的活化的介质都不大好,因此我觉得这个没有什么问题。   

此外如果是以FMN为辅酶的,那我还可以建议你试试蓝色琼脂糖凝胶,因为它的配基的结构和FMN的三个环很相似,它能纯化不少脱氢酶和激酶。

相应的偶联的材料,要自己合成亲和填料,有很多公司都提供活化好的介质,自己偶联就可以,其中比较常用的有启维益成公司的溴化氰琼脂糖凝胶,环氧琼脂糖凝胶,氨基琼脂糖凝胶,羧基琼脂糖凝胶,活化酯琼脂糖凝胶,以及巯基琼脂糖凝胶等,但是如果是小分子的配基最好选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好,此外也曾经有文献报导固定辅酶时,偶联位置不同,选择性有差别,因此你可以选择自己适合的活化介质。

不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求,所以要先对自己的配基有一个清楚的了解就可以选择合适的活化介质。

我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶,它能应用的范围广氨基巯基羟基都可以,而且合成的介质刚性好,非特异吸附少,所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定,配基脱落少。我觉得是不错的选择。

包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说。我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件。

层析复性很时髦,但是真正能用的不是很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。

3)Sephadex G-25(medium)柱脱盐时,盐浓度太高对柱效有影响吗?若有,一般对盐浓度限度如何?

大家别客气,除盐对于浓度应该也是有一定的限制的,同样的样品盐浓度高的自然要比浓度低的要在柱子上走的峰要宽些,相对需要的柱子的分辨率也要高点,但是在正常的范围如1-2M应该影响不大,不过要除得很干净还是尽量少上点样品,我觉得上样的体积毕竟比浓度的影响更大。

4)我的蛋白17kd左右,能跟肝素亲和,一般用离子交换和亲和层析纯化,现在我用聚乙二醇修饰它,分子量增加5000左右,修饰率不可能达到100%,请问修饰后能用什么纯化方法可以把修饰的和未经修饰的分开?(当然修饰后还残留有聚乙二醇,这个小分子也要除掉)

他们大多用凝胶过滤,我觉得这也不错的做法,毕竟PEG是链状的分子,在柱子上和普通蛋白行为不一样,修饰度越高那么出峰也越后,因此你的蛋白选择sephadex G50试试,它的范围在1000-30000,应该是不错的选择。此外PEG是个疏水性的链,修饰后的蛋白疏水性增强,修饰度越高,疏水性越强,可以用这个原理分离。离子交换也可以选择,因为同样道理,修饰度越高,电荷被屏蔽也越多,电荷也越少,因此应该修饰度越高越先出。亲和也离子交换一样的道理,你可以试试,你手头的亲和能不能分开,你在这几个方法里选择看哪个更经济好用就可以。

5)我有个问题困绕很久,从细菌中提取酶,好像用常规的方法(超声波破壁,缓冲液提取),总是拿不到我要的蛋白。是不是这种蛋白也是疏水性较强,需要加助溶剂才能提取出来?另外,我是不是也可以加点甘油或者PEG来提取?

其实这个问题我觉得是这样的,既然你是提取那肯定是有沉淀和上清,你的目标蛋白的分子量你是应该知道的,那么跑电泳先看它到底是在上清还是沉淀里,剩下的问题你再解决如何提取。

对于不同的酶要看酶稳定如何,你可以用不同的PH去提取,我曾经提取一个酶用水就是提取不出来,需要用盐才能提取出来,多试试,设计个方案,这样才能解决问题,所以不一定加甘油就管用,你还得注意破碎本身会不会有问题,倒回去做做也许能找到真正的原因。有什么问题继续探讨。

6)HPLC是用来分析检测或分离纯化?

如果可以用来纯化,上样量那么小有什么意义呢?

如果是用来分析检测,怎样指导以后的分离纯化工作呢?

HPLC既可以做分析也可以做制备,纯化上样量小,这样分离效果好,就可能得到很纯的物质,同时配合质谱等就可以得到很多单一蛋白的特性包括序列等,这些纯度高的组分是用一般的纯化方法做不到的。HPLC重现性好,定量准确,所以也可以用于定量和定性,是分析中不可缺少的工具。

分析出来后如果这个物质很稳定,直接线性放大就可以做大规模的制备,因此摸好了分析的条件也就相应有了制备的条件。

来源:北京启维益成科技有限公司试剂部
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